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Shuji Hatakeyama, MD, PhD; Norio Sugaya, MD; Mutsumi Ito, DVM; Masahiko Yamazaki, MD; Masataka Ichikawa, MD; Kazuhiro Kimura, MD, PhD; Maki Kiso, DVM; Hideaki Shimizu; Chiharu Kawakami; Kazuhiko Koike, MD, PhD; Keiko Mitamura, MD; Yoshihiro Kawaoka, DVM, PhD

RÉSUMÉ
Contexte On sait peu de choses sur la fréquence de génération et de transmissibilité des virus influenza B ayant une sensibilité réduite aux inhibiteurs de la neuraminidase. Par ailleurs, la transmission de virus résistants influenza de type A ou B, n'a pas été reconnue à ce jour.

Objectif Evaluer la prévalence et la transmissibilité des virus de type B ayant une sensibilité réduite aux inhibiteurs de la neuraminidase.

Schéma, environnement et patients Investigation de la sensibilité des inhibiteurs de la neuraminidase d'isolats d'influenza B chez 74 enfants et après traitement par oseltamivir et chez 348 patients non traités ayant une grippe (dont 66 adultes) examinés dans 4 hôpitaux communautaires au Japon durant la saison grippale 2004-2005. Quatre-cent vingt deux virus de patients non traits et 74 échantillons de patients après traitement par oseltamivir ont été analysés.

Principaux critères de jugement Un test d'inhibition à la sialidase était utilisé pour évaluer les sensibilités médicamenteuses des virus influenza B. Les gènes neuraminidase and hémagglutinine des virus montrant une sensibilité réduite aux inhibiteurs de la neuraminidase ont été séquencés pour identifier les mutations possédant le potentiel à conférer une réduction de la sensibilité à ces médicaments.

Résultats Chez 1 enfant (1.4%) sur 74 ayant reçu oseltamivir, nous avons mis en évidence un variant ayant une réduction de la sensibilité au médicament possédant une substitution sur la neuraminidase Gly402Ser. Nous avons aussi mis en évidence des variants ayant une sensibilité réduite porteur de mutations de type Asp198Asn, Ile222Thr, ou Ser250Gly pour 7 virus (1.7%) sur 422 chez des patients non traités. Le revue des informations cliniques et génétique virale disponibles chez ces 7 patients indiquaient que 4 avaient une probabilité d'avoir été infectés au sein de la communauté alors que les 3 restants avaient probablement été infectés par contact avec des frères et soeurs libérant un virus mutant.

Conclusions Dans cette population, les virus influenza B ayant une réduction de la sensibilité aux inhibiteurs de la neuraminidase ne se rencontrent pas aussi fréquemment que les virus influenza A résistants. Toutefois, ils semblent être transmis au sein de la communauté et des familles, ce qui nécessite un suivi continu et rapproché.

JAMA. 2007;297:1435-1442

L'utilisation clinique de tout antiviral peut entraîner le développement de virus résistants.^1,2 Deux inhibiteurs de la neuraminidase, le zanamivir et l'oseltamivir, sont efficaces contre la grippe et sont utilisés assez largement dans le traitement de cette infection, en particulier au Japon. ^3,4 Nous avons avec d'autres documenté l'émergence de virus de type A résistants à l'oseltamivir, y compris les sous-types H5N1,^3,5-7 mais le même type d'informations sur les virus influenza de type B est limité. Bien que les virus influenza de type B entraîne généralement des épidémies plus faibles que les virus de type A, ils sont néanmoins associés à des épidémies annuelles et à des taux excessifs de mortalité à travers le monde.⁸

Parmi les deux types de virus B ayant une sensibilité réduite qui ont fait l'objet de rapports, un était porteur d'une mutation Arg152Lys (système de numération des acides aminés adapté pour un N2 neuraminidase⁹; la numération N2 est utilisée tout au long de cet article) dans la neuraminidase et a été isolé d'un enfant immuno-compromis traité par zanamivir.¹⁰ L'autres virus avait une mutation Asp198As neuraminidase et a été isolé d'un enfant immuno-compromis traité par oseltamivir.¹¹ Les substitutions connues de la neuraminidase identifiées dans les virus résistants chez l'homme tendent à être spécifiques de type ou de sous-type : Glu119Val, Arg292Lys, et Asn294Ser pour la neuraminidase du sous-type N2; His274Tyr dans celle du sous-type N1 (y compris non seulement les virus H1N1 mais aussi les virus H5N1)6,7et Arg152Lys et Asp198Asn dans celle des virus de type B.¹0,¹¹ Toutes ses substitutions ont été identifiées dans des résidus catalytiques ou structuraux dans les sites actifs de la sialidase de la protéine neuraminidase,9 qui sont relativement conservés dans toutes les molécules de neuraminidase de type A et de type B et sont les cibles des inhibiteurs de la neuraminidase.

Voir une version plus large (11K): [dans cette fenêtre] [dans une nouvelle fenêtre]   Figure 1.. Distribution des participants

Les résultats des expériences sur culture cellulaire dans lesquelles des passages multiples sont nécessaires pour la production de virus résistants aux inhibiteurs de la neuraminidase¹² ont suggéré que la résistance à ces agents survient rarement. Il est donc raisonnable qu'une fréquence faible de résistance à l'oseltamivir—5,5% des enfants âgés de 1 à 12 ans infectés par des virus de type A et 0% des enfants infectés par des virus de type B—ait été observée dans un essai clinique.¹³ Des études plus récentes ont toutefois démontré un taux plus élevé que ce qui était attendu de production de virus influenza résistants de type A chez des enfants traités par oseltamivir: 18% des enfants ayant une infection par un virus H3N2 5 et 16% ayant une infection par un virus de type H1N1 ³ démontraient des variants résistants avec des mutations de la neuraminidase après traitement médicamenteux.

Le fitness biologique des virus résistants aux inhibiteurs de la neuraminidase diffèrent selon le type de mutations de la neuraminidase. Dans les études chez la souris ou le furet, l'infectivité et la transmissibilité des isolats cliniques des virus humains influenza A portant une mutation Arg292Lys ou His274Tyr de leurs neuraminidases étaient compromises^14-17; un résultat similaire a été rapporté pour un virus mutant de type B porteur d'une mutation Arg152Lys chez les furets.¹0 En comparaison, un virus résistant avec une mutation Glu119Val ayant infecté les furets, a été transmis chez ces animaux aussi efficacement que le type sauvage du virus.¹⁷ Le virus influenza B porteur d'une substitution Asp198Asn croit de même que le type sauvage du virus dans ce modèle animal.¹⁸ Néanmoins, la pathogénicité et la transmissibilité des virus résistants aux inhibiteurs de la neuraminidase demeurent des questions en suspens porteuses d'une signification pour prédire des souches pandémiques.

Au Japon, les inhibiteurs de la neuraminidase, le zanamivir et l'oseltamivir ont été approuvés pour un usage clinique respectivement en 2000 et 2001 et sont maintenant utilisés plus intensivement que partout ailleurs dans le monde.^3,4 Au cours ded l'hiver 2004-2005, un virus influenza B entraînait une épidémie à large échelle au Japon, créant des opportunités pour évaluer dans un contexte naturel la prévalence et la transmission des virus influenza de type B ayant une sensibilité réduite aux inhibiteurs de la neuraminidase. Les résultats rapportés ici suggèrent un taux faible mais notable d'émergence de virus de type B ayant une sensibilité réduite aux inhibiteurs de la neuraminidase et leur transmission de personne à personne, à la fois dans la communauté et au sein de simples familles.

METHODES
Population de l'étude et contextes Des prélèvements pharyngé et nasal pour analyse à la recherche de virus influenza de type B ont été pratiqués chez des patients qui consultaient dans le service de pédiatrie de 4 hôpitaux généraux du Japon durant la période grippale de 2004-2005. Afin d'identifier la fréquence de développement des virus influenza de type B résistants à la neuraminidase après traitement par oseltamivir, nous avons analysé les échantillons appariés de chaque patient, l'un prélevé lors de la consultation initiale à l'hôpital (échantillon avant traitement) et l'autre au cours du traitement par oseltamivir (échantillon après traitement). Les patients diagnostiqués comme ayant une infection par virus influenza de type B par un kit de diagnostic rapide qui recevaient un traitement par oseltamivir, et desquels pouvaient être recueillis au moins deux échantillons en séquence pour isoler le virus, étaient inclus dans la première série d'études (FIGURE 1). Dans la deuxième série, nous avons essayé d'évaluer dans un contexte civil la prévalence des virus influenza de type B ayant une sensibilité réduite aux inhibiteurs de la neuraminidase. A ces fins, nous avons obtenu des échantillons avant le traitement par oseltamivir à partir des patients qui consultaient dans les 4 hôpitaux généraux. Le virus influenza de type B isolé dans ces échantillons et les virus des échantillons avant traitement de la première série d'études ont été combinés et analysés (Figure 1). Ces études incluant des patients consultant dans des hôpitaux généraux, plusieurs membres des familles ont consulté au même endroit. Un consentement oral a été obtenu des parents de tous les patients. Cette étude a été menée après approbation des comités d'éthique de 3 des 4 hôpitaux; dans le cas du seul hôpital sans comité d'éthique, les activités liées à l'étude ont été menées sous les auspices du consentement informé.

Echantillons cliniques et virus

Les prélèvements pharyngé et nasal destinés à isoler le virus influenza de type B étaient recueillis par le médecin traitant après obtention du consentement informé. Les virus isolés étaient stockés à-80°C jusqu'à leur utilisation. Les isolats du virus étaient utilisés comme population mixte sans purification de la plaque. Des cellules rénales canine Madin-Darby surexprimant le gène β-galactoside 2,6-sialyltransférase I (ST6Gal I) 19 étaient utilisées pour isoler le virus et pour le test sur plaque. Ces cellules permettent la croissance d'isolats cliniques de virus influenza humain mieux que les cellules rénales canines Madin-Darby non manipulées.¹⁹ Pour évaluer la sensibilité des virus influenza B aux inhibiteurs de la neuraminidase, la concentration d'inhibiteur de neuraminidase nécessaire pour inhiber 50% de l'activité de la sialidase des virus (IC50) était déterminée avec des isolats de virus B avant et après traitement à l'aide d'un test d'inhibition de la sialidase.^19,20 Les valeurs IC50 montrées dans cette étude ont été évaluées pour des virus présents dans des liquides supernatants de culture, sans purification de la plaque des isolats. Pour les souches démontrant une diminution de la sensibilité aux inhibiteurs, nous avons séquencé les gènes de la neuraminidase et de l'hémagglutinine.

Sensibilité de la sialidase aux inhibiteurs de la neuraminidase

Les sensibilités de la sialidase des virus influenza de type B aux inhibiteurs de la neuraminidase étaient évaluées par un test d'inhibition de la sialidase décrit précédemment.^19,20 En bref, l'acide 2'-(4-méthylumbelliféryl)-;-D-N-acétylneuraminique (MUNANA; Sigma, St Louis, Mo) à la concentration finale de 0.1 mmol/l était utilisé comme substrat.

Dix microlitres de dilution virale (prédéfinie pour contenir une activité sialidase dans une zone de 800-1200 unités de fluorescence dans ce test) et 10 µl d'un inhibiteur de la neuraminidase (0.01 nmol/l à 10 µmol/l) dans une solution tampon calcium-MES (33 mmol/l 2-[N-morpholino] acide éthanesulfonique, 4 mmol/l CaCl2, pH 6.0) étaient mélangés et incubés à 37°C pendant 30 minutes, suivis par l'addition de 30 µl du substrat. Les mélanges étaient ensuite incubés à 37°C pendant 60 minutes, et la réaction était stoppée en ajoutant 150 µl de 0.1 mol/l d'hydroxide de sodium dans 80% d'éthanol (pH 10.0). Nous avons quantifié la fluorescence à une longueur d'onde de 360 nm permettant une stimulation et une émission de longueur d'onde de 465 nm. La valeur IC50 était déterminée par extrapolation de la relation entre la concentration de l'inhibiteur et le pourcentage d'inhibition de fluorescence. Les résultats sont rapportés sous la forme de moyenne des valeurs dupliquées de l'IC50. Le carboxylate d'oseltamivir (GS4071; Roche Products, Bâle, Suisse), le métabolite actif de la prodrogue éthyl ester phosphate d'oseltamivir, et le zanamivir (Relenza; GlaxoSmithKline, Brentford, UK) ont été utilisés comme inhibiteurs de la neuraminidase.

Analyse séquentielle des gènes de la neuraminidase et de l'hémagglutinine

L'ARN viral a été extrait du virus dans le liquide supernatant des cultures cellulaires grâce à un kit d'extraction de l'ARN (ISOGEN-LS; Nippon Gene, Tokyo, Japon), sans purification préalable de la plaque du virus. Une transcription inverse a été réalisée par transcriptase inverse (SUPERSCRIPT III; Invitrogen, Carlsbad, Californie) et un primer complémentaire (ou stimulus) à la fin 3' de l'ARN viral (5'-A G C A G A A G C A G A G C A-3'). Des produits ADNc ont été utilisés pour amplifier les gènes de la neuraminidase et de l'hémagglutinine par une méthode de réaction en chaîne par la polymérase (Pfu Ultra DNA Polymerase; Stratagene, La Jolla, Calif) (primer des séquences et conditions d'amplification disponibles auprès des auteurs sur demande). Nous avons cloné ces produits dans un vecteur pCRBlunt II-TOPO (Invitrogen) et les avons transformés en cellules chimiquement compétentes TOP10 (Invitrogen). Les cellules transformées ont poussé dans un milieu Luria broth agar contenant 50 mg/l de kanamycine, après lequel les colonies résistantes à la kanamycine ont été sélectionnées et incubées dans un milieu de Luria à 37°C toute une nuit dans un incubateur mis en mouvement continu. L'ADN plasmide a été extrait par un système MagExtractor-plasmid (TOYOBO, Osaka, Japon). Nous avons determiné les séquences complètes des gènes de la neuraminidase et de l'hémagglutinine par un séquençage cyclique grâce à une chimie de fin de séquençage par colorant (Big Dye; Applied Biosystems, Foster City, Californie) sur les auto-séquenceurs Applied Biosystems 3100 ou 3130Xl utilisant M13F-20, primers spécifiques de la neuraminidase ou de l'hémagglutinine. Pour chaque échantillon, 5 à 8 clones d'ADNc des gènes de la neuraminidase et de l'hémagglutinine ont été analysés.

RESULTATS
Population de l'étude

Au total, 75 paires d'échantillons avant et après traitement ont été recueillies auprès des patients pédiatriques. Une paire a été exclue car le virus influenza n'avait été isolé ni de l'échantillon pré-traitement ni de l'échantillon post-traitement. En conséquence, 74 patients âgés de 0 à 15 ans (médiane, 3 ans) ayant une infection par virus influenza B ont été inclus dans l'étude (Figure 1). Tous les patients étaient traités par oseltamivir pendant 5 jours. Dix-huit enfants ont reçu 2 mg/kg de poids corporel deux fois par jour, tandis que les autres 56 enfants recevaient des doses unitaires basées sur le poids 21(poids corporel 15 kg, 30 mg deux fois par jour; > 15-23 kg, 45 mg deux fois par jour; > 23-40 kg, 60 mg deux fois par jour et > 40 kg, 75 mg deux fois par jour).

Dans la deuxième série d'expérimentation, nous avons analysé au total 442 virus influenza B isolés de patients avant le traitement (348 patients plus les 74 patients mentionnés ci-dessus) au cours de la saison grippale 2004-2005 (Figure 1). Parmi les 422 patients, 356 étaient des enfants, âgés de 0 à 15 ans (médiane, 5 ans); les 66 autres patients étaient des adultes de 16 ans ou plus (extrêmes, 17 à 61 ans; médiane, 34 ans).

Emergence de virus influenza B ayant une sensibilité réduite aux inhibiteurs de la neuraminidase

Après traitement par oseltamivir, les virus ont été récupérés de tous les échantillons pré-traitement et de 65 échantillons post-traitement recueillis chez 74 enfants ayant reçu un traitement complet d'oseltamivir. Chez un enfant, (1.4%), la valeur IC50 de l'isolat testé après traitement contre zanamivir et oseltamivir avait été multiplié respectivement par 7.1 et 3.9, par rapport au virus isolé avant traitement (TABLE, patient 1). Cet enfant était un garçon de 7 ans, immunocompétent, ayant reçu de l'olsetamivir immédiatement après le diagnostic. Un virus ayant une sensibilité réduite aux inhibiteurs de la neuraminidase a été isolé d'un prélèvement pharyngé recueilli le 3ème jour après instauration du traitement par oseltamivir. Pour comprendre la base moléculaire de la réduction de la sensibilité observée aux médicaments, nous avons cloné le gène de la neuraminidase à partir du virus ayant cette propriété. L'analyse séquentielle a révélé une substitution d'acide amine Gly402Ser, dans 7 des 8 clones d'ADNc du gène de la neuraminidase. Aucune autre différence n'a été observée dans la séquence d'acides aminés des protéines de la neuraminidase et de l'hémagglutinine entre le parent de type sauvage et le virus mutant après traitement. La mutation de la neuraminidase Gly402Ser était située près du centre de l'enzyme sialidase.

Voir ce tableau: [dans cette fenêtre] [dans une nouvelle fenêtre]   Tableau.. Isolats influenza B ayant une sensibilité réduite aux inhibiteurs de la neuraminidase avant et après traitement antiviral

Virus influenza B ayant une diminution de la sensibilité aux inhibiteurs de la neuraminidase détectés chez des patients avant traitement

Les valeurs IC50 (extrêmes interquartiles) des virus influenza B isolés chez 422 patients non traités au cours de la saison grippale 2004-2005 et testés à la fois contre l'oseltamivir et le zanamivir avec un test d'inhibition de la sialidase ont été respectivement de 70.5 (55.8-85.1) nmol/l et 10.1 (7.0-15.8) nmol/l (FIGURE 2). Considérant le niveau d'augmentation de la valeur IC50 du virus à partir de l'échantillon après traitement par rapport à celle de la valeur du virus original recueilli avant le traitement par oseltamivir du patient 1, nous avons considéré les virus dont les valeurs IC50 étaient plus élevées de 1,5 fois par rapport à l'extrême interquartile supérieur au troisième quartile comme étant résistants au traitement (Figure 2). A l'aide de ce critère, 7 (1.7%) des 422 virus influenza B isolés de patients non traités (Tableau, patients 2-8) ont été trouvés comme ayant une sensibilité réduite au zanamivir, oseltamivir, ou aux deux. Chacun des 7 isolats ayant une sensibilité réduite contenait des substitutions d'acides aminés dans la neuraminidase au centre actif de la sialidase, en comparaison avec la séquence consensus de la neuraminidase de type B: 3 avaient des mutations Asp198Asn, trois avaient des mutations Ile222Thr, et un avait une mutation Ser250Gly (Tableau). Aucun de ces patients n'avait une affection sousjacente et aucun n'avait reçu de traitement immunosuppresseur.

Voir une version plus large (20K): [dans cette fenêtre] [dans une nouvelle fenêtre]   Figure 2.. Distribution des valeurs IC50 des virus Influenza B isolés chez 422 patients avant traitement, évalués contre carboxylate d'oseltamivir et zanamivir

Un garçon âgé de 8 ans a été diagnostiqué comme ayant une infection à virus influenza B 6 jours avant le début d'une grippe de type B chez sa soeur d'un an (patient 3). Les valeurs IC50 pour l'isolat avant traitement du patient 2 (47.4 nmol/l pour le zanamivir et 237.3 nmol/L pour l'oseltamivir) indiquaient une diminution de la sensibilité des isolats à ces composés. Nous avons identifié une mutation neuraminidase en position 198 (Asp198Asn) dans tous les 8 clones ADNc du gène de la neuraminidase de cet isolat. Le virus isolé du patient 3 montrait aussi une diminution de la sensibilité au zanamivir et à l'oseltamivir (Tableau).

Les analyses séquentielles des gènes de la neuraminidase et de l'hémagglutinine étaient identiques entre les virus isolés des patients 2 et 3, y compris par la présence d'une mutation Asp198Asn dans la protéine neuraminidase (dans tous les 8 clones ADNc du gène neuraminidase des isolats du patient 3). En conséquence, il est possible que le patient 2 ait été infecté par un virus influenza de type B ayant une sensibilité réduite aux inhibiteurs de la neuraminidase et ait transmis ce virus à sa sœur, le patient 3.

Un autre virus influenza B possédant une mutation Asp198Asn de la neuraminidase a été isolé du patient 4 (âgée de 6 ans, sexe féminin) le 9 février 2005, avant le traitement par oseltamivir (Tableau). Cette mutation de la neuraminidase a été observée dans les 7 clones de l'ADNc de cet isolat. Sa sœur de 4 ans, chez laquelle un virus influenza de type B avait été isolé le 31 janvier 2005, avait reçu de l'oseltamivir entre le 31 janvier et le 4 février (Tableau). Ces séquences de gènes à la fois de la neuraminidase et de l'hémagglutinine des deux patients étaient identiques, à l'exception d'une substitution d'un acide aminé de la neuraminidase en position 198. En conséquence, il est possible qu'un virus résistant au traitement ait pu surgir chez la sœur de 4 ans au cours du traitement par oseltamivir et ait été transmis au patient 4. Toutefois, ayant été incapables d'obtenir des échantillons après le traitement par oseltamivir chez cette enfant de 4 ans, nous ne pouvons prouver que ceci a été le cas.

Les valeurs IC50 des mutants Asp198Asn allaient de 42 à 62 nmol/l (zanamivir) et de 204 à 255 nmol/l (oseltamivir), indiquant que la mutation était associée à des réductions respectives de la sensibilité de 3 à 4 fois et de 4 à 6 fois par rapport aux valeurs médianes correspondantes IC50 pour le groupe entier des virus de type B. Le variant ayant une sensibilité réduite à l'oseltamivir avec une mutation Asp198Asn récemment identifiée par Gubareva11 et par Mishin et al18 dans une échantillon après traitement chez un enfant immuno-compromis ayant un virus influenza de type B. Ceci est en faveur de la notion que cette mutation a été introduite au cours du traitement par oseltamivir et qu'elle diminue la sensibilité aux inhibiteurs à la neuraminidase.

Plusieurs virus de type B porteurs des mutations de la neuraminidase ayant une diminution de la sensibilité ont également été identifiée chez d'autres patients. Des virus porteurs de la mutation Ile222Thr ont été isolés sur des échantillons avant traitement chez trois 3 patients: patients 5 et 6 (fratrie) et patient 7 (Tableau). Les séquences nucléotidiques des gènes de la neuraminidase et de l'hémagglutinine des isolats de ces patients étaient identiques, et une mutation de la neuraminidase Ile222Thr a été observée chez tous les clones d'ADNc de chaque gène viral NA. Les valeurs IC50 des virus porteurs de la mutation Ile222Thr allaient de 443 à 514 nmol/l (oseltamivir), ce qui représente une diminution de la sensibilité de six à sept fois par rapport aux valeurs médianes IC50 pour les virus de type B (Tableau). Cette mutation semblait ne pas avoir d'effet majeur sur la sensibilité virale au zanamivir. Un virus influenza B ayant une sensibilité réduite aux inhibiteurs de la neuraminidase a également été isolé du patient 8, une femme de 22 ans (Tableau). L'isolat du patient 8 possédait une mutation Ser250Gly pour les 7 clones ADNc du gène de la neuraminidase. La mutation Ser250Gly conférait une résistance multipliée par environ 19 fois au zanamivir (par rapport à la valeur médiane IC50 du virus de type B), mais ne diminuait pas la sensibilité à l'oseltamivir.

Aucun des membres de la famille des patients 2, 5, 7, et 8 n'a été affecté par le virus influenza B avant le début des symptômes, suggérant qu'ils aient pu infectés par des mutants ayant une diminution de la sensibilité et circulant au sein de la communauté. Ces résultats suggèrent que les virus influenza B ayant une diminution de la sensibilité aux inhibiteurs de neuraminidase pourraient être transmis de personne à personne, non seulement au sein des mêmes familles mais aussi parmi les membres d'une même communauté.

Voir une version plus large (182K): [dans cette fenêtre] [dans une nouvelle fenêtre]   Figure 3.. Localisations des mutations sur la structure en 3D de la neuraminidase

Enfin, nous n'avons pas observé de différence appréciable dans l'évolution clinique de l'infection virale entre les patients infectés par le type sauvage des virus ou ceux ayant une diminution de la sensibilité aux inhibiteurs à la neuraminidase. Les durées moyennes de la fièvre après traitement antiviral ont été respectivement de 2.4, 2.6, et 2.0 jours chez les infectés par les virus de type sauvage (n=32), chez ceux ayant une sensibilité réduite aux inhibiteurs de la neuraminidase (patient 2 [3 jours], patient 3 [5.5 jours], patient 7 [1 jour], patient 8 [1 jour]), et patient ayant le variant s'étant développé au cours du traitement (patient 1). De même, nous n'avons pas trouvé de différence appréciable concernant l'importance de la diffusion du virus (durée et titre), entre les patients infectés par un virus résistant au traitement et ceux infectés par un virus sensible au traitement. Toutefois, le nombre de patients infectés par des virus ayant une sensibilité réduite au traitement est trop faible pour évaluer la signification statistique de l'effet de la résistance au traitement sur la diffusion du virus.

COMMENTAIRES
Nous avons démontré que les virus influenza B ayant une sensibilité réduite aux inhibiteurs de la neuraminidase peuvent émerger au cours de traitements systématiques et que ces mutants semblent être transmis de personne à personne, non seulement au sein d'une même famille, mais peut-être aussi par contacts au sein de la communauté. Le taux de production du virus influenza de type B ayant une sensibilité réduite au cours d'un traitement par oseltamivir dans cette étude, 1.4%, est plus faible que celui des virus influenza de type A (5.5%-18%).3,5,13 Cette différence pourrait refléter les doses plus élevées d'oseltamivir utilisées dans notre étude (76% des patients ayant reçu des doses thérapeutiques par rapport à leur poids, en contraste à la dose biquotidienne de 2 mg/kg administrée uniformément dans les études japonaises précédentes^3,5).

Quatre mutations de la neuraminidase de type B diminuent la sensibilité aux inhibiteurs de la neuraminidase : substitutions Asp198Asn, Ile222Thr, Ser250Gly, et Gly402Ser. Les résidus 198, 222, et 250 sont situés dans la structure du site actif de la neuraminidase, qui interagit avec les résidus catalytiques des liens hydrogènes ou des ponts salins (FIGURE 3).^9,22 Les résidus structuraux Asp198 et Ser 250 (le résidu correspondant de la neuraminidase de type A est Ala) interagissent avec les résidus catalytiques Arg152 et Arg224, respectivement, et Ile222 forme une poche hydrophobique dans laquelle vient s'insérer le substrat.²² La nouvelle substitution détectée dans la neuraminidase d'un virus retrouvé chez un patient traité par oseltamivir dans cette étude est survenue au niveau du résidu 402. Bien que Gly402 ne soit pas un résidu catalytique ou structural, il est situé près du centre enzymatique de la sialidase (Figure 3). En conséquence, la substitution Gly402Ser peut modifier l'interaction du centre enzymatique et des inhibiteurs de la neuraminidase, entraînant une diminution de la sensibilité au traitement. D'autres analyses sont nécessaires pour comprendre l'interaction de ce résidu avec l'acide sialique.

Les mutations structurales que nous avons mises en évidence semblent diminuer la sensibilité à l'oseltamivir de façon modérée par rapport à la mutation catalytique Arg292Lys. En les testant contre l'oseltamivir, les valeurs IC50 des virus H3N2 porteurs d'une mutation structurale Glu119Val ou Asn294Ser étaient respectivement de 239 nmol/l ou 106 nmol/l,5 tandis que celle pour la souche H5N1 ayant une mutation structurale His274Tyr était de 763 nmol/L.⁶ D'un autre côté, la mutation catalytique Arg292Lys des virus N2 conférait un niveau élevé de résistance à l'oseltamivir (IC50 >10 000 nmol/l).⁵ Les virus ayant des mutations structurales peuvent avoir une capacité de transmission chez les animaux sous expérimentation, comme il a été démontré pour un variant de type A ayant une mutation structurale en position 119 ou 274.¹⁷ Ces résultats suggèrent que les virus influenza ayant une mutation structurale de la neuraminidase peuvent constituer un problème clinique, même si leurs valeurs IC50 sont plus faibles que celles des virus ayant des mutations du domaine catalytique. En conséquence, les rapports récents sur la résistance à l'oseltamivir des virus influenza A H5N1 ayant une mutation structurale His274Tyr ^6,7 nécessite une attention particulière et un suivi soigneux de l'extension des variants résistants.

La question reste de savoir si les variants isolés des patients non traits démontrent une transmissibilité de personne à personne dans la communauté ou l'émergence spontanée de mutants ayant une sensibilité réduite au traitement. Nous pensons plutôt à la première possibilité car le << réseau global de sensibilité aux inhibiteurs de la neuraminidase >> n'a pas mis en évidence de virus influenza présentant une résistance aux inhibiteurs de la neuraminidase avant que ces traitements ne soient introduits en clinique.^23,24 Toutefois, au cours des trois premières saisons grippales (1999-2002) suivant l'introduction des inhibiteurs de la neuraminidase sur le marché, le réseau a détecté un faible nombre (8 [0.35%] sur 2287 isolats) de virus influenza, isolés chez des patients non traités, ayant une sensibilité diminuée aux inhibiteurs de la neuraminidase.²⁵ Parmi ceux-ci, 2 possédaient des mutations de la neuraminidase avant d'être identifiés dans des virus résistants aux inhibiteurs de la neuraminidase. Par ailleurs, au cours de la saison grippale 2003-2004, le réseau a mis en évidence 3 virus H3N2 parmi 1180 échantillons recueillis au Japon qui contenaient des mutations de la neuraminidase conférant une résistance aux inhibiteurs de la neuraminidase, bien qu'il ne soit pas possible de déterminer avec certitude si ces patients avaient été exposés aux inhibiteurs de la neuraminidase ou s'il s'agissait d'individus traités par inhibiteur de la neuraminidase.²⁶ Nos observations sont compatibles avec celles des données de surveillance, qui impliquent une transmission possible de virus résistants aux inhibiteurs de la neuraminidase de personne à personne.

Lorsque des enfants sains reçoivent de l'oseltamivir à raison de 2 mg/kg de poids corporel, le pic moyen de concentration plasmatique du carboxylate d'oseltamivir, le métabolite actif du médicament, est de 630 nmol/l chez les enfants âgés de 3 à 5 ans et de 426 nmol/l chez les enfants âgés de 2 ans.²⁷ Ceci indique que les valeurs IC50 pour les virus influenza B testés contre l'oseltamivir dans notre étude étaient proches de la concentration plasmatique, suggérant que ce traitement peut ne pas être aussi efficace contre le virus influenza B que contre le virus influenza A. En comparaison, la concentration locale de zanamivir dans le tractus humain respiratoire est estimé être plus de 10 000 nmol/l lorsque les adultes sains inhalant 10 mg de zanamivir, 28 bien au-dessus des valeurs IC50 du virus influenza B.

Au Japon, les prescriptions d'oseltamivir ont été estimées être 90 fois plus fréquentes que celles du zanamivir au cours de la saison grippale 2004-2005 (note officielle du Ministère de la Santé, du Travail et des Affaires Sociales du Japon). Il est donc possible que les mutants ayant une sensibilité réduite au traitement observes dans les communautés de cette étude aient été générés par la large utilisation de l'oseltamivir. Une surveillance continue de l'émergence ou de la diffusion de virus influenza résistants aux inhibiteurs de la neuraminidase est d'une importance majeure.

Enfin, l'évolution clinique de l'infection due au virus influenza de type B dans cette étude ne semble pas être affectée par la sensibilité du virus aux inhibiteurs de la neuraminidase, bien qu'il soit nécessaire d'étudier de grands nombres de cas pour confirmer cette impression. Néanmoins, les symptômes des patients infectés par les virus ayant des sensibilités réduites aux inhibiteurs de la neuraminidase ont été similaires à ceux des patients infectés par le type sauvage du virus, ce qui montre que ces virus mutants, au moins ceux porteurs d'une mutation structurale, ne perdent pas de virulence, même s'ils ont évolué vers un statut qui est moins sensible au traitement. D'autres études des propriétés biologiques des virus influenza résistants aux inhibiteurs de la neuraminidase sont nécessaires pour pleinement évaluer leur pathogénicité chez l'homme.

Informations sur les auteurs
Correspondance: Yoshihiro Kawaoka, DVM, PhD, Division of Virology, Department of Microbiology and Immunology, Institute of Medical Science, University of Tokyo, 4-6-1 Shirokanedai, Minato-ku, Tokyo 108-8639, Japan (kawaoka{at}ims.u-tokyo.ac.jp).

Contributions des auteurs: Les Drs Hatakeyama et Kawaoka ont eu un accès complet à toutes les données de l'étude et acceptent la responsabilité de l'intégrité des données et de l'exactitude de l'analyse des données.

Conception et schema de l'étude: Hatakeyama, Sugaya, Kawaoka.

Recueil des données: Hatakeyama, Ito, Yamazaki, Ichikawa, Kimura, Kiso, Shimizu, Kawakami,Mitamura.

Analyse et interprétation des données: Hatakeyama, Koike, Kawaoka.

Revue critique du manuscrit: Sugaya, Ito, Yamazaki, Ichikawa, Kimura, Kiso, Shimizu, Kawakami, Koike, Mitamura, Kawaoka.

Analyse statistique: Hatakeyama.

Obtention du financement: Kawaoka.

Aide administrative, technique et matérielle: Sugaya.

Supervision de l'étude: Kawaoka.

Liens financiers: Le Dr Kawaoka déclare avoir reçu des honoraires d'orateur de Chugai Pharmaceuticals, Novartis, Sankyo, Toyama Chemical, et Wyeth, et une bourse de Chugai Pharmaceuticals, Daiichi Pharmaceutical, Sankyo, et Toyama Chemical. Le Dr Sugaya déclare avoir reçu des honoraires d'orateur de Chugai Pharmaceuticals, Sankyo Pharmaceuticals, et Takeda. Le Dr Koike déclare avoir reçu une bourse de Chugai Pharmaceuticals. Les informations rapportées dans cette étude ont été incluses dans une demande de licence pour de nouvelles substitutions d'acides aminés à l'origine d'une modification de la sensibilité aux inhibiteurs de la neuraminidase, compositions contenant ces substitutions, et méthodes pour les détecter. Aucun autre lien financier n'a été déclaré.

Financement/Soutien: ce travail a bénéficié du soutien sous la forme de bourses de Core Research for Evolutional Science and Technology (CREST), Japon; de bourses de la Japan Science and Technology Agency (JST); e bourses du Ministère de l'Education, Culture, Sports, Science et Technologie et du Ministère de la Santé, du Travail et des Affaires Sociales du Japon; et de bourses du National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health. Le carboxylate d'oseltamivir utilise dans cette étude était fourni par Produits Roche.

Rôle des sponsors: Aucune des sources de financement n'a joué de rôle dans le schéma ou la conduite de l'étude, le recueil, le contrôle, la gestion, l'analyse ou l'interprétation des données, ni dans la préparation, la revue ou l'approbationdu manuscrit.

Remerciements: Nous remercions le biostatisticien Hiroshi Ohtsu, MS (Department of Clinical Bioinformatics, University of Tokyo), pour ses conseils sur les analyses statistiques. Nous remercions Larisa Gubareva, PhD (Department of Internal Medicine, University of Virginia Health Sciences Center), pour nous avoir indiqué un protocole pour le test d'inhibition de la sialidase, John Gilbert, BS (travailleur indépendant), pour avoir publié le manuscrit, et Krisna Wells, BS, RN (University of Wisconsin-Madison), pour son assistance technique. Nous remercions aussi Hideo Cho, MD (Department of Pediatrics, Kawasaki Municipal Hospital, Kanagawa, Japan), pour sa supervision. Aucune des personnes remerciées n'a reçu de compensation à l'exception de John Gilbert, qui avait un contrat et a reçu un salaire mensuel du Dr Kawaoka afin de fournir ses services éditoriaux.

Affiliations des auteurs: Division of Virology, Department of Microbiology and Immunology, Institute of Medical Science (Drs Hatakeyama, Ito, Kiso, et Kawaoka), Department of Infectious Diseases, Graduate School of Medicine (Drs Hatakeyama et Koike), and International Research Center for Infectious Diseases, Institute of Medical Science (Dr Kawaoka), University of Tokyo, Tokyo, Japan; Department of Pediatrics, Keiyu Hospital, Kanagawa, Japan (Dr Sugaya); Core Research for Evolutional Science and Technology (CREST), Japan Science and Technology Agency, Saitama (Drs Ito, Kiso, et Kawaoka); Zama Children's Clinic, Kanagawa (Dr Yamazaki); Department of Pediatrics, Isehara Kyodo Hospital, Kanagawa (Drs Ichikawa and Kimura); Kawasaki City Institute of Public Health, Kanagawa (Mr Shimizu); Yokohama City Institute of Health, Kanagawa (Ms Kawakami); Department of Pediatrics, Eiju General Hospital, Tokyo (Dr Mitamura); Department of Pathobiological Sciences, School of Veterinary Medicine, University of Wisconsin-Madison (Dr Kawaoka).

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Des nouvelles sur la résistance médicamenteuse du virus influenza de type B qui ne peuvent être ignorées
Anne Moscona et Jennifer McKimm-Breschkin
JAMA. 2007;297:1492-1493.
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